Ewolucja neutralna

Poprzedni wpis powstał na samym początku mojego doktoratu, teraz już minęło od tego czasu ponad 9 miesięcy. W swojej pracy badawczej próbuję zajmować się właśnie fosforylacją białek, więc na pewno będę jeszcze o niej pisał na tych łamach. Póki co, aby rozładować suspens, wspomnę tylko, że w odróżnieniu od pepsyny, w przypadku której obecnośćm lub nie fosforu, nie ma, jak widzieliśmy, dramatycznego wpływu na aktywność, wiele białek jest regulowanych za pomocą fosforylacji. Przyłączanie i odłączanie grup fosforanowych (fosforylacja i defosforylacja), procesy enzymatyczne katalizowane odpowiednio przed kinazy i fosfatazy, mogą więc spełniać rolę "włączania" i "wyłączania" białek wewnątrz komórek (przy czym czasem aktywna jest forma z fosforem, a czasem ta bez). W 1992 r. E. H. Fisher i  E. G. Krebs dostali nagrodę Nobla w dziedzinie medycyny za badania nad "odwracalną fosforylacją jako biologicznym mechanizmem regulacyjnym".

Tym razem chciałbym jednak zwrócić uwagę na inne zagadnienie, które dziś przykuło moją uwagę: ewolucję neutralną. Problem jest następujący: załóżmy, że mamy kompleks białkowy w formie obręczy, składający się z 8 podjednostek. Tego typu pierścieniowate kompleksy (niekoniecznie 8-członowe) wchodzą w skład "maszyn molekularnych" odpowiedzialnych za bardzo ważne funkcje, takie jak synteza ATP, transport substancji przez błony biologiczne, niszczenie niepotrzebnych białek itd. Załóżmy, że w dość pierwotnym orgnizmie, dajmy na to bakterii E. coli, widzimy, że ten kompleks składa się z 8 takich samych podejdnostek A, u wyższych zaś organizmów - dwóch różnych, B i C, ułożonych w pierścieniu na przemian, przy czym po sekwencji widać, że geny b i c pochodzą od genu a, który w pewnym momencie się "skopiował" ("zduplikował"), a potem każda z dwóch kopii trochę ewoluowała. Pojawia się następujące pytanie: dlaczego nastąpił taki proces? Ewolucjoniści zazwyczaj odpowiedziliby: pierścień składający się z 4 B i 4 C musi mieć jakąś przewagę nad pierścieniem składającym się z 8 A, co więcej, musiał on mieć taką przewagę już prawie na samym początku, gdy tylko B i C zaczęły odróżniać się od A. Owa przewaga zapobiegła utracie drugiej kopii genu i powrotowi do kompleksu składającego się z 8 A (albo innymi słowy: te organizmy, u których taka utrata nastąpiła, gorzej sobie radziły niż te, u których nie nastąpiła i z czasem zostały te, u których nie nastąpiła).

Możliwe jest jednak inne wytłumaczenie. Białka B i C pierwotnie wyglądające zupełnie tak samo jak A, razem wchodziły w skład pierścieniowego kompleksu w losowych kombinacjach. Z czasem, co zrozumiałe, zarówno B jak i C stopniowo odróżniały się od A, akumulując drobne zmiany o neutralnym bądź pozytywnym skutku dla całego organizmu. Zmiany o negatywnym skutku (załóżmy, że polegały one na utracie zdolności tworzenia pierścienia) nie były akumulowane w populacji. Można sobie jednak wyobrazić, że część zmian, która miałaby negatywny skutek, gdyby istniał tylko jeden gen, miała neutralny skutek w przypadku, gdy istniały dwa różne geny. Np. mutacja, która sprawiła, że B nie może oddziaływać z samym sobą, tworząc 8-członowy pierścień byłaby negatywna, gdyby obecny był tylko gen kodujący B. Jednak możliwe, że ta mutacja nadal pozwala na oddziaływanie między B i C, a tym samym pozwala na tworzenie kompleksu, w którym obie podjednostki ułożone są na przemian: B, C, B, C itd. W ten sposób owa zmiana ma nadal charakter neutralny, ale tylko dopóty, dopóki obecne są obydwie kopie, B i C. Tym samym, niemożliwy jest powrót do sytuacji sprzed duplikacji genu A, choć kompleks składający się z B i C nie ma żadnej przewagi nad kompleksem składającym się tylko z A. Mamy więc nieodwracalność przy jednoczesnej neutralności.

Fosforylacja białek - wstęp

Wracając do pisania tego bloga po trochę dłuższej przerwie, chciałbym zamieścić kilka wpisów na temat fosforylacji białek. Zacznę od wstępu.

Początki współczesnej biochemii, dziedziny zajmującej się badaniem cząsteczek wchodzących w skład organizmów żywych, sięgają końca XIX i początku XX. wieku. Wtedy to, równolegle w wielu miejscach na świecie, zaczęto izolować i oczyszczać składniki żywych komórek, identyfikować różne rodzaje białek, kwasów nukleinowych. Prym wiedli naukowcy z Ameryki, Niemiec, Wielkiej Brytanii i Rosji, ale wyróżniające miejsce zajmowali też Polacy, choćby Augustyn Wróblewski (1866-po 1913), jeden z pionierów, obok laureata Nagrody Nobla z 1907 r., Eduarda Buchnera, badań nad enzymami (a prywatnie anarchista i w ogóle barwna osobowość - pojawia się w "Zakopanoptikonie" Andrzeja Struga jako Augustyn Rigoletto) i Jakub Karol Parnas (1884-1949), który zajmował się głównie metabolizmem, ale położył zasługi właściwie we wszystkich dziedzinach biochemii (takiej, jaka istniała przed wojną). O tych postaciach z pewnością jeszcze nie raz będzie na łamach tego bloga.

Jeszcze w pierwszej połowie XIX w. odkryto, że białka zasadniczo składają się z węgla wodoru, azotu i tlenu. Czasem znajdowano także siarkę, a czasem fosfor. Dziś wiemy, że fosforu teoretycznie nie powinno być: żaden z 20 aminokwasów, z których składają się białka, nie zawiera fosforu. Niemniej jednak na początku XX wieku nie ulegało już wątpliwości, że takie białka jak np. kazeina i fosfityna, odgrywające ważne role w procesie karmienia młodych u zwierząt (kazeina znajduje się w mleku ssaków, a fosfityna – w żółtku jaj) - posiadają wysoki procent fosforu. Brytyjczyk Robert H. A. Plimmer (1877-1955) odkrył w pierwszych latach XX w., że fosfor można oddzielić chemicznie od kazeiny działając na nią zasadą sodową.

W publikacji z 1930 r. John H. Northrop opisał proces oczyszczania i krystalizacji pepsyny, enzymu trawiącego białka. W tamtym czasie nie było pewności, czy enzymy są białkami, czy nie (m.in. z powodu wpływu Richarda Willstättera, laureata Nagrody Nobla z 1915 r., który, opierając się na wynikach swoich eksperymentów, twierdził, że nie) – dziś wiemy, że oczywiście tak. Gdy roztwór białka staje się przesycony, np. z powodu odparowania części wody lub dodania substancji silnie oddziałującej z wodą (tzw. precipitantów - substancje te "odciągają" część wody od białka, sprawiając, że efekt jest podobny do tego, gdyby ubyło wody np. wskutek odparowania), część białka przechodzi z roztworu do fazy stałej, tworząc osad lub – jeśli warunki są odpowiednie – kryształy. (Jest to analogiczne zjawisko do tworzenia się kryształów na nitce zanurzonej w stężonym rotworze soli kuchennej, w miarę odparowywania z niego wody.) Obecnie takie kryształy białka służą do pomiarów strukturalnych: ponieważ w krysztale cząsteczki białka są ułożone równomiernie i regularnie według określonych zasad symetrii, mierzone sygnały pochodzące od pojedynczych cząsteczek ulegają wzmocnieniu (inaczej niż w roztworze, gdzie cząsteczki znajdują się w przypadkowych pozycjach i w związku z tym poszczególne sygnały nawzajem się wygaszają). Użyłem słowa "sygnały" na określenie różnych mierzalnych fizyko-chemicznych parametrów. Jednym z nich może być np. to, jak cząsteczka białka rozprasza promienie Roentgena – jeśli mamy do dyspozycji kryształ i aparat rentgenowski, możemy łatwo to zmierzyć, a z uzyskanych wyników wyliczyć, przy użyciu komputera, położenie gęstości elektronowych, odpowiedzialnych za rozpraszanie promieniowania, a tym samym skonstruować model budowy atomowej białka (na tym polega tzw. krystalografia rentgenowska białek). W tamtych czasach – w latach 30. i 40. – krystalizacja nie służyła do rozwiązywania struktur, była po prostu najlepszą metodą wydzielania czystych form enzymów. Izolowanie białek ze skomplikowanych mieszanin, jakie spotykamy w komórkach i tkankach, jest zadaniem karkołomnym, ale jeśli w danych warunkach tylko jedno białko krystalizuje (a to się zdarza, bo białka mają bardzo specyficzne warunki krystalizacji; co więcej, tylko niektóre białka łatwo krystalizują), można je wyizolować w dość czystej formie, a następnie – poprzez cykle rozcieńczania i ponownej krystalizacji – dokładnie oczyścić. Właśnie za tego typu procedury, które umożliwiły uzyskanie czystych próbek enzymów i białek wirusowych, przyznano w 1946 r. Nagrodę Nobla Jamesowi B. Summerowi, Wendellowi M. Stanleyowi i wspomnianemu wyżej Johnowi H. Northropowi. Biorąc pod uwagę fakt, że dziesięć lat później kryształy miały już służyć do badania struktury atomowej białek, była to nagroda w pewnym sensie prorocza.

Wróćmy jednak do pracy opisującej kryształy pepsyny. Jedyna obserwacja z tej pracy, na którą chciałbym zwrócić uwagę, to analiza składu atomowego pepsyny. Nie mając pewności, czy pepsyna jest białkiem, czy jakimś innym rodzajem substancji, powiedzmy kwasem nukleinowym, Northrop zbadał zawartość dwóch ważnych pierwiastków, azotu i fosforu. Okazało się, że pepsyna zawiera pewną, niewielką co prawda (niewiele poniżej 1 %), ilość fosforu, która nie zmniejszała się w trakcie oczyszczania białka. Northrop przywołuje wyniki Cornelisa A. Pekelharinga (z 1896 r.) i Willema E. Ringera (z 1915 r.), dwóch wybitnych holenderskich lekarzy i naukowców z Utrechtu (Ringer był następcą Pekelharinga, który z kolei był następcą Dondersa; ten ostatni był natomiast następcą Gerrita J. Muldera, pierwszym naukowcem zajmującym się badaniem białek), którzy również badali pepsynę (Pekelharing wyizolował ją jeszcze w XIX w., ale nie udało mu się jej wykrystalizować) i nie wykryli w niej fosforu. Northrop doszedł więc do wniosku, że możliwe są aktywne formy pepsyny zarówno z fosforem, jak i bez fosforu.

Z perspektywy czasu wyniki te można interpretować w następujący sposób. Białka składają się z aminokwasów, a te z kolei z węgla, tlenu, azotu, wodoru, czasem siarki. Nie powinno więc być w nich fosforu. Fosfor, jeśli istnieje, jest modyfikacją – dodatkiem, doczepionym w pewnych miejscach białka. W przypadku pepsyny obecność tego dodatku zdaje się nie wpływać ani pozytywnie, ani negatywnie, na funkcjonowanie białka (przynajmniej w tym sensie, że możo ono być aktywne zarówno z, jak i bez, fosforu). W szeregu publikacji z początku lat 50. XX w. (pierwsza była prawdopodobnie grupa badawcza Jamesa N. Davidsona z Uniwersytetu w Glasgow, ucznia wybitnego niemieckiego biochemika, laureata Nagrody Nobla z 1931 r., Ottona Warburga; sam Davidson miał duży wkład w badanie kwasów nukleinowych - wykazał, że DNA i RNA są normalnymi składnikami komórek zwierzęcych i roślinnych, że DNA jest głównie w jądrze, a RNA zarówno w jądrze, jak i cytoplzmie itd.; oprócz tego jest autorem klasycznych, choć przestarzałych już, podręczników do biochemii kwasów nukleinowych), wykorzystując ortofosforan (VI) zawierający radioaktywny izotop fosforu, ³²P, wykazano, że wewnątrz komórek, zwłaszcza komórek rakowych, fosfor jest nieustannie przyłączany do białek (co można zaobserwować jako pochłanianie radioaktywności przez frakcję komórki, która zawiera głównie białka; kluczowym etapem w tych eksperymentach jest frakcjonowanie komórki, zwłaszcza oddzielenie kwasów nukleinowych od białek, bo kwasy nukleinowe zawsze zawierają fosfor). Tak więc na początku lat 50. XX w. można było przypuszczać, że fosfor jest doczepiany do niektórych białek, ale jak i po co – nie było wiadomo. 

Tutaj możesz znaleźć wykład noblowski Northropa z 1946 r.