Wracając do pisania tego bloga po trochę dłuższej przerwie, chciałbym zamieścić kilka wpisów na temat fosforylacji białek. Zacznę od wstępu.
Początki współczesnej biochemii, dziedziny zajmującej się badaniem cząsteczek wchodzących w skład organizmów żywych, sięgają końca XIX i początku XX. wieku. Wtedy to, równolegle w wielu miejscach na świecie, zaczęto izolować i oczyszczać składniki żywych komórek, identyfikować różne rodzaje białek, kwasów nukleinowych. Prym wiedli naukowcy z Ameryki, Niemiec, Wielkiej Brytanii i Rosji, ale wyróżniające miejsce zajmowali też Polacy, choćby Augustyn Wróblewski (1866-po 1913), jeden z pionierów, obok laureata Nagrody Nobla z 1907 r., Eduarda Buchnera, badań nad enzymami (a prywatnie anarchista i w ogóle barwna osobowość - pojawia się w "Zakopanoptikonie" Andrzeja Struga jako Augustyn Rigoletto) i Jakub Karol Parnas (1884-1949), który zajmował się głównie metabolizmem, ale położył zasługi właściwie we wszystkich dziedzinach biochemii (takiej, jaka istniała przed wojną). O tych postaciach z pewnością jeszcze nie raz będzie na łamach tego bloga.
Jeszcze w pierwszej połowie XIX w. odkryto, że białka zasadniczo składają się z węgla wodoru, azotu i tlenu. Czasem znajdowano także siarkę, a czasem fosfor. Dziś wiemy, że fosforu teoretycznie nie powinno być: żaden z 20 aminokwasów, z których składają się białka, nie zawiera fosforu. Niemniej jednak na początku XX wieku nie ulegało już wątpliwości, że takie białka jak np. kazeina i fosfityna, odgrywające ważne role w procesie karmienia młodych u zwierząt (kazeina znajduje się w mleku ssaków, a fosfityna – w żółtku jaj) - posiadają wysoki procent fosforu. Brytyjczyk Robert H. A. Plimmer (1877-1955) odkrył w pierwszych latach XX w., że fosfor można oddzielić chemicznie od kazeiny działając na nią zasadą sodową.
W publikacji z 1930 r. John H. Northrop opisał proces oczyszczania i krystalizacji pepsyny, enzymu trawiącego białka. W tamtym czasie nie było pewności, czy enzymy są białkami, czy nie (m.in. z powodu wpływu Richarda Willstättera, laureata Nagrody Nobla z 1915 r., który, opierając się na wynikach swoich eksperymentów, twierdził, że nie) – dziś wiemy, że oczywiście tak. Gdy roztwór białka staje się przesycony, np. z powodu odparowania części wody lub dodania substancji silnie oddziałującej z wodą (tzw. precipitantów - substancje te "odciągają" część wody od białka, sprawiając, że efekt jest podobny do tego, gdyby ubyło wody np. wskutek odparowania), część białka przechodzi z roztworu do fazy stałej, tworząc osad lub – jeśli warunki są odpowiednie – kryształy. (Jest to analogiczne zjawisko do tworzenia się kryształów na nitce zanurzonej w stężonym rotworze soli kuchennej, w miarę odparowywania z niego wody.) Obecnie takie kryształy białka służą do pomiarów strukturalnych: ponieważ w krysztale cząsteczki białka są ułożone równomiernie i regularnie według określonych zasad symetrii, mierzone sygnały pochodzące od pojedynczych cząsteczek ulegają wzmocnieniu (inaczej niż w roztworze, gdzie cząsteczki znajdują się w przypadkowych pozycjach i w związku z tym poszczególne sygnały nawzajem się wygaszają). Użyłem słowa "sygnały" na określenie różnych mierzalnych fizyko-chemicznych parametrów. Jednym z nich może być np. to, jak cząsteczka białka rozprasza promienie Roentgena – jeśli mamy do dyspozycji kryształ i aparat rentgenowski, możemy łatwo to zmierzyć, a z uzyskanych wyników wyliczyć, przy użyciu komputera, położenie gęstości elektronowych, odpowiedzialnych za rozpraszanie promieniowania, a tym samym skonstruować model budowy atomowej białka (na tym polega tzw. krystalografia rentgenowska białek). W tamtych czasach – w latach 30. i 40. – krystalizacja nie służyła do rozwiązywania struktur, była po prostu najlepszą metodą wydzielania czystych form enzymów. Izolowanie białek ze skomplikowanych mieszanin, jakie spotykamy w komórkach i tkankach, jest zadaniem karkołomnym, ale jeśli w danych warunkach tylko jedno białko krystalizuje (a to się zdarza, bo białka mają bardzo specyficzne warunki krystalizacji; co więcej, tylko niektóre białka łatwo krystalizują), można je wyizolować w dość czystej formie, a następnie – poprzez cykle rozcieńczania i ponownej krystalizacji – dokładnie oczyścić. Właśnie za tego typu procedury, które umożliwiły uzyskanie czystych próbek enzymów i białek wirusowych, przyznano w 1946 r. Nagrodę Nobla Jamesowi B. Summerowi, Wendellowi M. Stanleyowi i wspomnianemu wyżej Johnowi H. Northropowi. Biorąc pod uwagę fakt, że dziesięć lat później kryształy miały już służyć do badania struktury atomowej białek, była to nagroda w pewnym sensie prorocza.
Początki współczesnej biochemii, dziedziny zajmującej się badaniem cząsteczek wchodzących w skład organizmów żywych, sięgają końca XIX i początku XX. wieku. Wtedy to, równolegle w wielu miejscach na świecie, zaczęto izolować i oczyszczać składniki żywych komórek, identyfikować różne rodzaje białek, kwasów nukleinowych. Prym wiedli naukowcy z Ameryki, Niemiec, Wielkiej Brytanii i Rosji, ale wyróżniające miejsce zajmowali też Polacy, choćby Augustyn Wróblewski (1866-po 1913), jeden z pionierów, obok laureata Nagrody Nobla z 1907 r., Eduarda Buchnera, badań nad enzymami (a prywatnie anarchista i w ogóle barwna osobowość - pojawia się w "Zakopanoptikonie" Andrzeja Struga jako Augustyn Rigoletto) i Jakub Karol Parnas (1884-1949), który zajmował się głównie metabolizmem, ale położył zasługi właściwie we wszystkich dziedzinach biochemii (takiej, jaka istniała przed wojną). O tych postaciach z pewnością jeszcze nie raz będzie na łamach tego bloga.
Jeszcze w pierwszej połowie XIX w. odkryto, że białka zasadniczo składają się z węgla wodoru, azotu i tlenu. Czasem znajdowano także siarkę, a czasem fosfor. Dziś wiemy, że fosforu teoretycznie nie powinno być: żaden z 20 aminokwasów, z których składają się białka, nie zawiera fosforu. Niemniej jednak na początku XX wieku nie ulegało już wątpliwości, że takie białka jak np. kazeina i fosfityna, odgrywające ważne role w procesie karmienia młodych u zwierząt (kazeina znajduje się w mleku ssaków, a fosfityna – w żółtku jaj) - posiadają wysoki procent fosforu. Brytyjczyk Robert H. A. Plimmer (1877-1955) odkrył w pierwszych latach XX w., że fosfor można oddzielić chemicznie od kazeiny działając na nią zasadą sodową.
W publikacji z 1930 r. John H. Northrop opisał proces oczyszczania i krystalizacji pepsyny, enzymu trawiącego białka. W tamtym czasie nie było pewności, czy enzymy są białkami, czy nie (m.in. z powodu wpływu Richarda Willstättera, laureata Nagrody Nobla z 1915 r., który, opierając się na wynikach swoich eksperymentów, twierdził, że nie) – dziś wiemy, że oczywiście tak. Gdy roztwór białka staje się przesycony, np. z powodu odparowania części wody lub dodania substancji silnie oddziałującej z wodą (tzw. precipitantów - substancje te "odciągają" część wody od białka, sprawiając, że efekt jest podobny do tego, gdyby ubyło wody np. wskutek odparowania), część białka przechodzi z roztworu do fazy stałej, tworząc osad lub – jeśli warunki są odpowiednie – kryształy. (Jest to analogiczne zjawisko do tworzenia się kryształów na nitce zanurzonej w stężonym rotworze soli kuchennej, w miarę odparowywania z niego wody.) Obecnie takie kryształy białka służą do pomiarów strukturalnych: ponieważ w krysztale cząsteczki białka są ułożone równomiernie i regularnie według określonych zasad symetrii, mierzone sygnały pochodzące od pojedynczych cząsteczek ulegają wzmocnieniu (inaczej niż w roztworze, gdzie cząsteczki znajdują się w przypadkowych pozycjach i w związku z tym poszczególne sygnały nawzajem się wygaszają). Użyłem słowa "sygnały" na określenie różnych mierzalnych fizyko-chemicznych parametrów. Jednym z nich może być np. to, jak cząsteczka białka rozprasza promienie Roentgena – jeśli mamy do dyspozycji kryształ i aparat rentgenowski, możemy łatwo to zmierzyć, a z uzyskanych wyników wyliczyć, przy użyciu komputera, położenie gęstości elektronowych, odpowiedzialnych za rozpraszanie promieniowania, a tym samym skonstruować model budowy atomowej białka (na tym polega tzw. krystalografia rentgenowska białek). W tamtych czasach – w latach 30. i 40. – krystalizacja nie służyła do rozwiązywania struktur, była po prostu najlepszą metodą wydzielania czystych form enzymów. Izolowanie białek ze skomplikowanych mieszanin, jakie spotykamy w komórkach i tkankach, jest zadaniem karkołomnym, ale jeśli w danych warunkach tylko jedno białko krystalizuje (a to się zdarza, bo białka mają bardzo specyficzne warunki krystalizacji; co więcej, tylko niektóre białka łatwo krystalizują), można je wyizolować w dość czystej formie, a następnie – poprzez cykle rozcieńczania i ponownej krystalizacji – dokładnie oczyścić. Właśnie za tego typu procedury, które umożliwiły uzyskanie czystych próbek enzymów i białek wirusowych, przyznano w 1946 r. Nagrodę Nobla Jamesowi B. Summerowi, Wendellowi M. Stanleyowi i wspomnianemu wyżej Johnowi H. Northropowi. Biorąc pod uwagę fakt, że dziesięć lat później kryształy miały już służyć do badania struktury atomowej białek, była to nagroda w pewnym sensie prorocza.
Wróćmy jednak do pracy opisującej kryształy pepsyny. Jedyna obserwacja z tej pracy, na którą chciałbym zwrócić uwagę, to analiza składu atomowego pepsyny. Nie mając pewności, czy pepsyna jest białkiem, czy jakimś innym rodzajem substancji, powiedzmy kwasem nukleinowym, Northrop zbadał zawartość dwóch ważnych pierwiastków, azotu i fosforu. Okazało się, że pepsyna zawiera pewną, niewielką co prawda (niewiele poniżej 1 %), ilość fosforu, która nie zmniejszała się w trakcie oczyszczania białka. Northrop przywołuje wyniki Cornelisa A. Pekelharinga (z 1896 r.) i Willema E. Ringera (z 1915 r.), dwóch wybitnych holenderskich lekarzy i naukowców z Utrechtu (Ringer był następcą Pekelharinga, który z kolei był następcą Dondersa; ten ostatni był natomiast następcą Gerrita J. Muldera, pierwszym naukowcem zajmującym się badaniem białek), którzy również badali pepsynę (Pekelharing wyizolował ją jeszcze w XIX w., ale nie udało mu się jej wykrystalizować) i nie wykryli w niej fosforu. Northrop doszedł więc do wniosku, że możliwe są aktywne formy pepsyny zarówno z fosforem, jak i bez fosforu.
Z perspektywy czasu wyniki te można interpretować w następujący sposób. Białka składają się z aminokwasów, a te z kolei z węgla, tlenu, azotu, wodoru, czasem siarki. Nie powinno więc być w nich fosforu. Fosfor, jeśli istnieje, jest modyfikacją – dodatkiem, doczepionym w pewnych miejscach białka. W przypadku pepsyny obecność tego dodatku zdaje się nie wpływać ani pozytywnie, ani negatywnie, na funkcjonowanie białka (przynajmniej w tym sensie, że możo ono być aktywne zarówno z, jak i bez, fosforu). W szeregu publikacji z początku lat 50. XX w. (pierwsza była prawdopodobnie grupa badawcza Jamesa N. Davidsona z Uniwersytetu w Glasgow, ucznia wybitnego niemieckiego biochemika, laureata Nagrody Nobla z 1931 r., Ottona Warburga; sam Davidson miał duży wkład w badanie kwasów nukleinowych - wykazał, że DNA i RNA są normalnymi składnikami komórek zwierzęcych i roślinnych, że DNA jest głównie w jądrze, a RNA zarówno w jądrze, jak i cytoplzmie itd.; oprócz tego jest autorem klasycznych, choć przestarzałych już, podręczników do biochemii kwasów nukleinowych), wykorzystując ortofosforan (VI) zawierający radioaktywny izotop fosforu, 32P, wykazano, że wewnątrz komórek, zwłaszcza komórek rakowych, fosfor jest nieustannie przyłączany do białek (co można zaobserwować jako pochłanianie radioaktywności przez frakcję komórki, która zawiera głównie białka; kluczowym etapem w tych eksperymentach jest frakcjonowanie komórki, zwłaszcza oddzielenie kwasów nukleinowych od białek, bo kwasy nukleinowe zawsze zawierają fosfor). Tak więc na początku lat 50. XX w. można było przypuszczać, że fosfor jest doczepiany do niektórych białek, ale jak i po co – nie było wiadomo.
Tutaj możesz znaleźć wykład noblowski Northropa z 1946 r.
