Fosforylacja białek - wstęp

Wracając do pisania tego bloga po trochę dłuższej przerwie, chciałbym zamieścić kilka wpisów na temat fosforylacji białek. Zacznę od wstępu.

Początki współczesnej biochemii, dziedziny zajmującej się badaniem cząsteczek wchodzących w skład organizmów żywych, sięgają końca XIX i początku XX. wieku. Wtedy to, równolegle w wielu miejscach na świecie, zaczęto izolować i oczyszczać składniki żywych komórek, identyfikować różne rodzaje białek, kwasów nukleinowych. Prym wiedli naukowcy z Ameryki, Niemiec, Wielkiej Brytanii i Rosji, ale wyróżniające miejsce zajmowali też Polacy, choćby Augustyn Wróblewski (1866-po 1913), jeden z pionierów, obok laureata Nagrody Nobla z 1907 r., Eduarda Buchnera, badań nad enzymami (a prywatnie anarchista i w ogóle barwna osobowość - pojawia się w "Zakopanoptikonie" Andrzeja Struga jako Augustyn Rigoletto) i Jakub Karol Parnas (1884-1949), który zajmował się głównie metabolizmem, ale położył zasługi właściwie we wszystkich dziedzinach biochemii (takiej, jaka istniała przed wojną). O tych postaciach z pewnością jeszcze nie raz będzie na łamach tego bloga.

Jeszcze w pierwszej połowie XIX w. odkryto, że białka zasadniczo składają się z węgla wodoru, azotu i tlenu. Czasem znajdowano także siarkę, a czasem fosfor. Dziś wiemy, że fosforu teoretycznie nie powinno być: żaden z 20 aminokwasów, z których składają się białka, nie zawiera fosforu. Niemniej jednak na początku XX wieku nie ulegało już wątpliwości, że takie białka jak np. kazeina i fosfityna, odgrywające ważne role w procesie karmienia młodych u zwierząt (kazeina znajduje się w mleku ssaków, a fosfityna – w żółtku jaj) - posiadają wysoki procent fosforu. Brytyjczyk Robert H. A. Plimmer (1877-1955) odkrył w pierwszych latach XX w., że fosfor można oddzielić chemicznie od kazeiny działając na nią zasadą sodową.

W publikacji z 1930 r. John H. Northrop opisał proces oczyszczania i krystalizacji pepsyny, enzymu trawiącego białka. W tamtym czasie nie było pewności, czy enzymy są białkami, czy nie (m.in. z powodu wpływu Richarda Willstättera, laureata Nagrody Nobla z 1915 r., który, opierając się na wynikach swoich eksperymentów, twierdził, że nie) – dziś wiemy, że oczywiście tak. Gdy roztwór białka staje się przesycony, np. z powodu odparowania części wody lub dodania substancji silnie oddziałującej z wodą (tzw. precipitantów - substancje te "odciągają" część wody od białka, sprawiając, że efekt jest podobny do tego, gdyby ubyło wody np. wskutek odparowania), część białka przechodzi z roztworu do fazy stałej, tworząc osad lub – jeśli warunki są odpowiednie – kryształy. (Jest to analogiczne zjawisko do tworzenia się kryształów na nitce zanurzonej w stężonym rotworze soli kuchennej, w miarę odparowywania z niego wody.) Obecnie takie kryształy białka służą do pomiarów strukturalnych: ponieważ w krysztale cząsteczki białka są ułożone równomiernie i regularnie według określonych zasad symetrii, mierzone sygnały pochodzące od pojedynczych cząsteczek ulegają wzmocnieniu (inaczej niż w roztworze, gdzie cząsteczki znajdują się w przypadkowych pozycjach i w związku z tym poszczególne sygnały nawzajem się wygaszają). Użyłem słowa "sygnały" na określenie różnych mierzalnych fizyko-chemicznych parametrów. Jednym z nich może być np. to, jak cząsteczka białka rozprasza promienie Roentgena – jeśli mamy do dyspozycji kryształ i aparat rentgenowski, możemy łatwo to zmierzyć, a z uzyskanych wyników wyliczyć, przy użyciu komputera, położenie gęstości elektronowych, odpowiedzialnych za rozpraszanie promieniowania, a tym samym skonstruować model budowy atomowej białka (na tym polega tzw. krystalografia rentgenowska białek). W tamtych czasach – w latach 30. i 40. – krystalizacja nie służyła do rozwiązywania struktur, była po prostu najlepszą metodą wydzielania czystych form enzymów. Izolowanie białek ze skomplikowanych mieszanin, jakie spotykamy w komórkach i tkankach, jest zadaniem karkołomnym, ale jeśli w danych warunkach tylko jedno białko krystalizuje (a to się zdarza, bo białka mają bardzo specyficzne warunki krystalizacji; co więcej, tylko niektóre białka łatwo krystalizują), można je wyizolować w dość czystej formie, a następnie – poprzez cykle rozcieńczania i ponownej krystalizacji – dokładnie oczyścić. Właśnie za tego typu procedury, które umożliwiły uzyskanie czystych próbek enzymów i białek wirusowych, przyznano w 1946 r. Nagrodę Nobla Jamesowi B. Summerowi, Wendellowi M. Stanleyowi i wspomnianemu wyżej Johnowi H. Northropowi. Biorąc pod uwagę fakt, że dziesięć lat później kryształy miały już służyć do badania struktury atomowej białek, była to nagroda w pewnym sensie prorocza.

Wróćmy jednak do pracy opisującej kryształy pepsyny. Jedyna obserwacja z tej pracy, na którą chciałbym zwrócić uwagę, to analiza składu atomowego pepsyny. Nie mając pewności, czy pepsyna jest białkiem, czy jakimś innym rodzajem substancji, powiedzmy kwasem nukleinowym, Northrop zbadał zawartość dwóch ważnych pierwiastków, azotu i fosforu. Okazało się, że pepsyna zawiera pewną, niewielką co prawda (niewiele poniżej 1 %), ilość fosforu, która nie zmniejszała się w trakcie oczyszczania białka. Northrop przywołuje wyniki Cornelisa A. Pekelharinga (z 1896 r.) i Willema E. Ringera (z 1915 r.), dwóch wybitnych holenderskich lekarzy i naukowców z Utrechtu (Ringer był następcą Pekelharinga, który z kolei był następcą Dondersa; ten ostatni był natomiast następcą Gerrita J. Muldera, pierwszym naukowcem zajmującym się badaniem białek), którzy również badali pepsynę (Pekelharing wyizolował ją jeszcze w XIX w., ale nie udało mu się jej wykrystalizować) i nie wykryli w niej fosforu. Northrop doszedł więc do wniosku, że możliwe są aktywne formy pepsyny zarówno z fosforem, jak i bez fosforu.

Z perspektywy czasu wyniki te można interpretować w następujący sposób. Białka składają się z aminokwasów, a te z kolei z węgla, tlenu, azotu, wodoru, czasem siarki. Nie powinno więc być w nich fosforu. Fosfor, jeśli istnieje, jest modyfikacją – dodatkiem, doczepionym w pewnych miejscach białka. W przypadku pepsyny obecność tego dodatku zdaje się nie wpływać ani pozytywnie, ani negatywnie, na funkcjonowanie białka (przynajmniej w tym sensie, że możo ono być aktywne zarówno z, jak i bez, fosforu). W szeregu publikacji z początku lat 50. XX w. (pierwsza była prawdopodobnie grupa badawcza Jamesa N. Davidsona z Uniwersytetu w Glasgow, ucznia wybitnego niemieckiego biochemika, laureata Nagrody Nobla z 1931 r., Ottona Warburga; sam Davidson miał duży wkład w badanie kwasów nukleinowych - wykazał, że DNA i RNA są normalnymi składnikami komórek zwierzęcych i roślinnych, że DNA jest głównie w jądrze, a RNA zarówno w jądrze, jak i cytoplzmie itd.; oprócz tego jest autorem klasycznych, choć przestarzałych już, podręczników do biochemii kwasów nukleinowych), wykorzystując ortofosforan (VI) zawierający radioaktywny izotop fosforu, ³²P, wykazano, że wewnątrz komórek, zwłaszcza komórek rakowych, fosfor jest nieustannie przyłączany do białek (co można zaobserwować jako pochłanianie radioaktywności przez frakcję komórki, która zawiera głównie białka; kluczowym etapem w tych eksperymentach jest frakcjonowanie komórki, zwłaszcza oddzielenie kwasów nukleinowych od białek, bo kwasy nukleinowe zawsze zawierają fosfor). Tak więc na początku lat 50. XX w. można było przypuszczać, że fosfor jest doczepiany do niektórych białek, ale jak i po co – nie było wiadomo. 

Tutaj możesz znaleźć wykład noblowski Northropa z 1946 r.

Nie każda wrażliwość na światło jest widzeniem

Nie każda czułość na światło to zmysł widzenia. Czasem, słysząc o tym, że proste organizmy (np. szkolny organizm modelowy, euglena zielona) potrafią rejestrować światło (słoneczne, w niektórych przypadkach także księżycowe, które jest oczywiście odbitym słonecznym, lub w warunkach laboratoryjnych - sztuczne), wyobrażamy sobie, że mają one zdolność bardzo prymitywnego widzenia, że np. w czasie dnia widzą one jakąś, powiedzmy, jasną, trochę zamgloną i niewyraźną plamę, a w nocy - czarną ciemność. W rzeczywistości jednak niewiele wskazuje na to, jakoby tak proste organizmy mogły posiadać zmysł widzenia, nawet w jakiejś szczątkowej (czy raczej zalążkowej) formie. O ile wiemy, takie zmysły, jakie istnieją u człowieka - zmysły umożliwiające  fenomenalny odbiór barw, dźwięków, tzn. taki, w którym zewnętrzny świat jakby wchodzi w nasze wnętrze w postaci wrażeń zmysłowych - wymagają, po pierwsze, odpowiednich organów poszczególnych, a po drugie, nadrzędnego organu, jakim jest mózg. Różne proste organizmy mogą odbierać informacje z otoczenia, więc istnieje w nich pewien poziom świadomości i swego rodzaju zmysły, ale nie posiadają one świadomości fenomenalnej, właściwej tylko wyższym zwierzętom. Innymi słowy, bakteria rejestrując, że otoczenie, w którym się znajduje, jest zimne, nie  odczuwa  zimna. Podobnie proste organizmy, które rejestrują światło, nie są w stanie mimo to niczego  zobaczyć. Z pewnością trzeba tu wiele poznawczej pokory, bo tak naprawdę nigdy się nie dowiemy, jak to jest "być bakterią" i "rejestrować światło, jak pierwotniak", poza tym - jeszcze raz trzeba to podkreślić - nawet bakteria posiada jakąś tam świadomość zmysłową, a nie tylko życie wegetatywne, jak rośliny, albo martwe istnienie właściwe obiektom nieożywionym. Niemniej jednak nasza wiedza jednoznacznie wskazuje na to, że bez centralnego układu nerwowego o świadomości fenomenalnej nie może być mowy i każde przypisywanie jej najprostszym organizmom jest jedynie jakąś projekcją ludzkich doświadczeń na zupełnie inną rzeczywistość. Przychodzi mi na myśl jeden możliwy przykład, który być może jest w stanie jakoś przybliżyć to rozróżnienie. Światło rejestrowane przez światłoczułe komórki siatkówki człowieka, czopki i pręciki, prowadzi do powstania w tych komórkach sygnałów nerwowych (czopki i pręciki to w końcu, jeśli chodzi o ich klasyfikację, drugorzędowe neurony), które następnie przesyłane są do kolejnych komórek nerwowych, różnego rodzaju komórek dwubiegunowych oraz ganglionowych, i dalej, przez tzw. nerw wzrokowy, do mózgu. Istnieje jednak także taki rodzaj komórek ganglionowych (stanowi on ok. 3% wszystkich komórek tego typu), który nie zajmuje się (tylko) przekazem sygnałów z czopków i pręcików, ale sam potrafi rejestrować światło (za pomocą właściwego mu światłoczułego pigmentu - melanopsyny - który wyłapuje szczególnie skutecznie światło niebieskie). U osób cierpiących na genetyczną chorobę retinitis pigmentosa (pl. retinopatia barwnikowa) pręciki i czopki obumierają, prowadząc do całkowitej ślepoty, mimo iż światłoczułe komórki ganglionowe są nadal obecne. Jednocześnie osoby ociemniałe w wyniku tego schorzenia, o ile mi wiadomo, nadal są świadome (mniej-więcej), kiedy jest noc, a kiedy dzień. Zegar dobowy człowieka potrafi oczywiście działać dość niezależnie od bodźców ze świata (co czasem jest przydatne, a czasem nie - np. stąd biorą się problemy z dostosowaniem się do zmiany czasu po podróży do innej strefy czasowej), ale tylko przez jakiś czas, zasadniczo jest on regulowany na podstawie bodźców świetlnych. Jak się wydaje, wspomniane wyżej światłoczułe komórki ganglionowe odgrywają ważną rolę w tym właśnie procesie. Mamy tu więc do czynienia ze "światłoczułością", która nie polega na "wejściu" barw obiektów zewnętrznych do "wnętrza" organizmu; światłoczułością, która nie jest widzeniem (pomijam publikację Daceya i współpracowników z 2005 r. opublikowaną w "Nature", nr 433, str. 749-754, w której autorzy sugerują, że te komórki mogą jednak mieć też jakąś rolę w normalnym procesie widzenia - jeśli mają, to chyba tylko pomocniczą względem pręcików i czopków, gdy te są aktywne, natomiast ich "poza-widzeniowe" funkcje są niezależne od innych komórek wzrokowych). Po prostu pewne czynności organizmu są regulowane w odpowiedzi na światło. W języku angielskim mówi się o "non visual photoreception" (nie-wizualnym odbiorze światła), którym charakteryzują się komórki posiadające melanopsynę (por. artykuł: Gooley i współpracownicy, A broad role for melanopsin in non-visual photoreception, "Journal of Neuroscience", 23, 7093-7106, 2003 r.). Myślę, że to zjawisko daje nam jakiś (bardzo nikły i tylko analogiczny, ale jednak) wgląd w to, jak "widzą" organizmy, które nie widzą, i w jaki sposób takie proste organizmy odbierają inne bodźce. I być może pozwalają nam lepiej docenić świadomość fenomenalną właściwą wyższym zwierzętom (u człowieka mamy oczywiście do czynienia jeszcze z "czymś więcej" - świadomością rozumną), a zwłaszcza zmysłu wzroku, który nie jest tylko "światłoczułością", ale czymś znacznie więcej - chwytaniem barw, kształtów, kierunków ruchu itp. z otoczenia.

Ewolucja zbieżna

Simon Conway Morris, wybitny specjalista z paleontologii kambru, jest znany z nagłaśniania, gdzie tylko może, zjawiska zwanego ewolucją zbieżną (konwergentną). O tego typu ewolucji mówimy, gdy procesy ewolucyjne zachodzące niezależnie od siebie i równolegle prowadzą do podobnych efektów, np. narządów spełniających te same funkcje (tzn. narządów analogicznych), podobnych mechanizmów ruchowych albo behawioralnych, podobnych "systemów społecznych" u zwierząt itd. Klasycznym przykładem tego rodzaju ewolucji są narządy wzroku, które wyewoluowały kilkakrotnie w historii przyrody: u owadów (oczy złożone), u mątw i ośmiornic (oczy fotograficzne) i kręgowców, w tym ludzi (również oczy fotograficzne). Gdy mówimy, że oczy fotograficzne u ośmiornic i u kręgowców są narządami analogicznymi, a nie homologicznymi, mamy na myśli to, że wspólny przodek ośmiornicy i kręgowców nie posiadał takich oczu i pojawiły się one w dwóch różnych "liniach genealogicznych" wychodzących od tego wspólnego przodka dopiero później.
W opinii wielu myślicieli, z Conwayem Morrisem na czele, zjawisko ewolucji konwergentnej zdaje się sugerować, że różnego rodzaju funkcje i procesy w pewnym sensie były zawsze potencjalnie obecne we wszechświecie dlatego, że jest on taki, jak jest (że jest w nim przestrzeń, światło, dźwięk, trzy stany skupienia itd.) i "czekały" na odpowiednie narządy, układy, mechanizmy, które będą mogły je zrealizować. Ten pogląd, ciekawe połączenie platonizmu z darwinizmem, Conway Morris prezentuje przede wszystkim w swojej książce "Life's solution" (CUP 2003), w której dochodzi do wniosku, że, w momencie, gdy pojawiło się na ziemi życie, ewolucja takich mniej więcej rodzajów organizmów, jakie rzeczywiście wyewoluowały, łącznie z inteligentnym zwierzęciem podobnym do Homo sapiens, była w pewnym sensie konieczna, bo różne "nisze", w tym "nisza inteligencji", czekały na zagospodarowanie. Jest to w pewnym sensie opinia przeciwna do tej, jaką prezentował sławny biolog Stephen J. Gould, który przed laty pisał, że gdyby "przewinąć taśmę" historii organizmów żywych i "puścić ją jeszcze raz", oglądalibyśmy zupełnie inny świat, w którym człowieka na pewno by nie było - w procesie ewolucji jest bowiem zbyt wiele miejsca na czysty przypadek. Conway Morris ma wielu przeciwników i jego wypowiedzi, zwłaszcza te zapuszczające się w filozoficzne bądź religijne rejony, prowokują często ostre riposty. Oczywiście to, że niektóre, najwyraźniej nie powiązane ze sobą wprost w sensie historycznym, gatunki mogą posiadać analogiczne narządy i mechanizmy uznają wszyscy. Niektórzy jednak argumentują, że czasem mamy w takich przypadkach do czynienia ze swego rodzaju zamaskowaną czy też głęboką homologią (ang. "deep homology") - np. narządy wzroku, choć, jak wspomniałem, wyewoluowały kilkakrotnie w różnych okolicznościach, za każdym razem potrzebowały do tego homologu genu PaxB/Pax-6 i jakiejś formy opsyny, może więc należałoby powiedzieć, że podobieństwo narządów analogicznych wynika z użycia podobnych mechanizmów na poziomie molekularnym, a nie wspólnego celu - funkcji widzenia - do którego dążą (ten i wiele podobnych przykładów głębokiej homologii opisują w fascynującym artykule "Deep homology and the origins of evolutionary novelty" Neil Shabin, Cliff Tabin i Sean Carroll w 457 numerze "Nature", niestety dostępnym tylko dla prenumeratorów i bibliotek). Conway Morris odpowiada, że te geny, choć rzeczywiście biorą udział w tworzeniu wszystkich znanych narządów wzroku, są również obecne u organizmów, które oczu nie mają (nie wiem, czy opsyna jest, ale na pewno Pax-6 - tak), więc proste powiązanie między np. Pax-6 i oczami, które mogłoby sugerować, że są one nieuniknionym skutkiem obecności pewnych mechanizmów na poziomie molekularnym. Można by też dodać, że nawet jeśli Pax-6 jest potrzebny, to nie dlatego, że np. ma dokładnie taką budowę, jaką ma, tylko dlatego, że spełnia pewna określoną funkcję (jest czynnikiem transkrypcyjnym regulującym pewnego rodzaju zestawy genów), więc gdyby w drodze ewolucji zbieżnej wyewoluował gen o tej samej funkcji, proces mógłby zajść bez Pax-6. Pierwszeństwo funkcji nad konkretną jej "aktualizacją", przy którym upiera się Conway Morris, można zauważyć więc już, gdy spojrzymy na to, co tak naprawdę jest ważne dla biologów w genach, narządach itp. - ich funkcje. Dla mnie to wszystko trochę nadto platońskie, ale z pewnością Conway Morris sieje dużo dobrego fermentu w środowisku ewolucjonistów i prowokuje ciekawe pytania.
O ewolucj i zbieżnej mówimy także na poziomie molekularnym, np. na poziomie sekwencji białek. Spójrzmy na enzymy o podobnej funkcji - np. proteazy, które degradują białka lub tną je na jakieś ściśle określone fragmenty. Znamy proteazy o bardzo różnych sekwencjach/strukturach (co świadczy o tym, że nie są bezpośrednio powiązane ze sobą historycznie), ale często w ich miejscach aktywnych spotyka się te same zestawy aminokwasów, np. u proteaz serynowych - zazwyczaj tzw. triadę katalityczną, składającą się z seryny, histydyny i asparaginianu (lub ewentualnie drugiej histydyny, jak w proteazie cytomegalowirusa), które są bezpośrednio zaangażowane w cięcie białek. Podobnie także różne inne motywy aminokwasowe czy pewne elementy struktury trzeciorzędowej (czy też tzw. "superdrugorzędowej", ang. supersecondary structure), powiązane z konkretną funkcją, spotyka się u białek nie powiązanych historycznie w sposób bezpośredni. Barry Honig, amerykański bioinformatykz Uniwersytetu Columbia, biorąc to pod uwagę, stworzył program Mark-Us (dostępny w internecie: http://luna.bioc.columbia.edu/honiglab/mark-us/cgi-bin/submit.pl), który analizuje strukturę białek o nieznanych funkcjach na podstawie podobieństw strukturalnych (istnienie takich samych motywów itp.) do białek o znanych funkcjach. To zupełnie unikatowe podejście, bo zazwyczaj porównuje się sekwencję kwasów nukleinowych w genie kodującym dane białko w poszukiwaniu powiązań historycznych międzi genami i na ich podstawie definiuje się podobieństwa w funkcji. To jest oczywiście często skuteczna metoda, a to dlatego, że (zgodnie z obecnym stanem wiedzy biologicznej) prawdziwe wydaje się następujące rozumowanie:
1) Białka blisko związane ze sobą historycznie są do siebie podobne, np. mają podobną budowę (zmiany eweolucyjne są stopniowe więc w krótkim czasie zasadniczo nie prowadzą do drastycznych zmian w budowie).
2) Jeśli białka są do siebie podobne, np. mają podobną budowę, mogę spełniać podobne funkcje, mieć podobne właściwości.
3) Z połączenia zdać 1 i 2 wynika, że jeśli białka są blisko związane historycznie to mogą mieć podobne funkcje/właściwości (ale nie muszą - dobrym przykładem mogą być tzw. pseudokinazy, białka, które są ewolucyjnie bardzo blisko związane z kinazami i są bardzo podobne, ale nie posiadają pewnych kluczowych aminokwasów, co sprawia, że nie potrafią spełniać takiej funkcji, jak kinazy, tzn. fosforylować inne białka albo małe cząsteczki).
Wyższość (przynajmniej filozoficzna) metody Honiga nad innymi metodami polega na tym, że nie idzie ona od zdania 1) przez 2) do 3), tylko wprost od zdania 2) do zdania 3), szuka podobieństw tu i teraz, niezależnie od tego, czy posiadają wspólną historię (bo, jak pokazuje ewolucja zbieżna, podobieństwa mogą istnieć również niezależnie). Niby to wszystko jest oczywiste, ale zwraca uwagę na prawdę, o której dzisiejsza biologia często zapomina: że rzeczy są takie, jakie są, ze względu na ich natury, w tym także ich strukturę i rozmaite właściwości, nie natomiast ze względu na to, w wyniku jakiego procesu się po raz pierwszy pojawiły (to jest powiązane z tym, jakie są, ale nie bezpośrednio). Ewolucja zbieżna pokazuje więc nie tyle platońską "wyższość funkcji nad jej konkretną aktualizacją", co arystotelejską wyższość(konkretnego) istnienia nad (abstrakcyjnym) "stawaniem się".